顯微操作技術(shù)

顯微操作技術(shù) 顯微操作技術(shù)（MicromanipulationTechnique）是指在高倍倒置顯微鏡下，利用顯微操作器（Micromanipulator），控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機(jī)械裝置，用來進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。

目前，以細(xì)胞內(nèi)微注射和微灌注技術(shù)為基礎(chǔ)的玻璃針頭(GlassNeedle，精細(xì)的玻璃微量毛細(xì)移液管)的使用，已經(jīng)在越來越多的實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究領(lǐng)域中成為一項(xiàng)非常普遍的操作方法，比如在體外受精、轉(zhuǎn)基因中等等。描述這些技術(shù)*恰當(dāng)?shù)脑拺?yīng)當(dāng)稱其為---顯微操作，因?yàn)檫@些操作是通過單個(gè)的或多個(gè)的筒狀玻璃微量移液管、**的定位裝置（顯微操作器）以及微量注射器或微量灌注器來在單個(gè)的細(xì)胞上進(jìn)行的。

顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等，例如多莉羊就是運(yùn)用細(xì)胞核移植技術(shù)而成功的；而轉(zhuǎn)基因技術(shù)指的是將外源基因?qū)塍w細(xì)胞并能穩(wěn)定的嵌入宿主動物的生殖細(xì)胞染色體中的一門技術(shù)，基因轉(zhuǎn)殖動物被定義為由人為的方式將外源基因引入體內(nèi)而引起基因改變的動物，并可將遺傳特質(zhì)傳遞到接續(xù)的每一世代中。

 微注射應(yīng)用的范圍非常廣泛，從輔助（體外）細(xì)胞受精技術(shù)至分子和細(xì)胞基本組分的轉(zhuǎn)運(yùn)都需使用這一技術(shù)，比較典型的是將某些物質(zhì)注射進(jìn)細(xì)胞中以操作和/或監(jiān)測某種特定的存活細(xì)胞中的基本機(jī)體生物化學(xué)狀態(tài)。這些可以注射進(jìn)細(xì)胞的物質(zhì)包括有：各種細(xì)胞器、激酶、組織化學(xué)標(biāo)志物（比如辣根過氧化物酶或者熒光黃）、蛋白質(zhì)、代謝物質(zhì)、微磁頭、離子、抗體、基因、分子生物學(xué)的mRNA和DNA等等。運(yùn)用這一技術(shù)，也可以實(shí)現(xiàn)用于單個(gè)細(xì)胞或一組細(xì)胞的較少量（皮升至毫升）藥劑或**的**輸送（微灌注），例如藥理學(xué)的**檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因動物的制作，可以利用基因微注射（gene microinjection）、胚干細(xì)胞（embryonic stem cells,ES cells）、精子載體（sperm vector）、反轉(zhuǎn)錄病毒感染（retroviral vectorinfection）及體細(xì)胞核移置（somatic cell nucleartransfer）等方法達(dá)成，其中顯微注射為目前應(yīng)用*普遍之方法之一。

顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細(xì)（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組（rearrangement）、缺失（deletion）、復(fù)制（duplication）或易位（translocation）等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。這種顯微注射術(shù)的程序，需有相當(dāng)精密的顯微操作設(shè)備，制造長管尖時(shí)，需用微量吸管拉長器（micropipettepuller），注射時(shí)需有固定管尖位置的微量操作器。這種技術(shù)的長處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細(xì)胞內(nèi)。此法已成功運(yùn)用于包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉(zhuǎn)殖動物。

以顯微注射法轉(zhuǎn)外源基因沒有長度上的限制，目前已證明數(shù)百kb之DNA片段均可以成功產(chǎn)制出轉(zhuǎn)基因動物。其缺點(diǎn)是設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長時(shí)間的練習(xí)，以及每次只能注射有限的細(xì)胞。這些操作中所使用的微量移液管是用毛細(xì)管拉針器(pipettepuller)來制作的，先將玻璃毛細(xì)管加熱到其熔化的溫度，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關(guān)，它可以用于精準(zhǔn)的移液。這種**度可以為各種類型和任意大小的細(xì)胞提供亞皮克升級或0.1微米(micron)范圍內(nèi)的**的、重復(fù)性良好的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞旁注射。通過運(yùn)用直接的水壓（壓力注射）或者不通過使用水流，而通過施加一電場來使帶電離子運(yùn)動（離子電滲法），都可以獲得將微量移液管中的物質(zhì)擠噴出去的效果。

目前*常用來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方式為：直接把重組過的 DNA 注入授精卵的原核(pronuleus) 中，將從胚胎提供者的輸卵管中取得的授精卵移到倒置顯微鏡上的微量注射臺上，然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之后注射針則依序穿過 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，將 DNA注入，注入時(shí)可以見到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的顯微注射為例，顯微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射針（injectionneedle）制備很困難，除影響操作時(shí)間外，也是影響轉(zhuǎn)基因效率及基因注入后之胚胎存活及轉(zhuǎn)基因成功與否極其重要的因子。固定吸管之內(nèi)、外徑分別為30、80μm是較為合適的，顯微注射針自針尖起20μm處的外徑為4μm時(shí)，可獲得良好的轉(zhuǎn)染效率。固定吸管的內(nèi)徑如果太小，會導(dǎo)致吸力不足，對受精卵操控不易；如太大，則受精卵易受傷害，影響胚胎的存活率。顯微注射針尖如果太粗，則導(dǎo)致插入透明帶及原核的阻力增加，且DNA流量過多，受精卵易于裂解；太細(xì)則導(dǎo)致針內(nèi)DNA流出速率過慢，且易阻塞，而使DNA無法順利流入原核內(nèi)，影響注射效率。因此進(jìn)行受精卵雄原核的顯微注射時(shí)，如何制備適用固定受精卵的吸管及顯微注射針是關(guān)乎轉(zhuǎn)基因效率極其重要的因素。

 轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）在目前生物及醫(yī)學(xué)研究方面的應(yīng)用極為廣泛，轉(zhuǎn)基因小鼠一直是研究外源基因構(gòu)筑型態(tài)、染色體嵌插、轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)及調(diào)節(jié)的*佳模式，也是建立轉(zhuǎn)基因技術(shù)*好的工具，尤其是在轉(zhuǎn)基因家畜之前，先以小鼠進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)是求事半功倍不可或缺的過程。

轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用的領(lǐng)域可以包括研究基因的活動對致癌病毒與癌細(xì)胞的生長的影響、基因的活動與**細(xì)胞間的交互作用與調(diào)控的機(jī)制、研究基因?qū)τ谏L的調(diào)控機(jī)制，以及生物學(xué)與遺傳學(xué)的機(jī)制，也被應(yīng)用于以人類細(xì)胞作為組織及器官移植的發(fā)展方面，如基因參與體細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及存在各個(gè)組織的干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化研究等等。轉(zhuǎn)基因動物除用于一般基礎(chǔ)研究外，對于制造具有**效果的蛋白質(zhì)、器官移植、疫苗、毒理實(shí)驗(yàn)、動物品種改良及水產(chǎn)養(yǎng)殖等均有很大的貢獻(xiàn)。雖然截至目前為止，轉(zhuǎn)基因的研發(fā)已有若干良好的成果，但尚有若干問題待克服，所以轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展將是不可限量的。為了使科研人員能夠順利進(jìn)行上述的實(shí)驗(yàn)并得到有意義的結(jié)果，這些實(shí)驗(yàn)中所使用的設(shè)備不僅應(yīng)當(dāng)有特殊的功能，還應(yīng)當(dāng)同時(shí)有很高的、過硬的質(zhì)量，能夠提供確保結(jié)果正確所需的可靠性、**性以及可重復(fù)性。

美國哈佛儀器公司(HarvardApparatus)即生產(chǎn)并銷售可用于成功完成微注射和/和微灌注所需的整套產(chǎn)品．如Harvard/醫(yī)療系統(tǒng) PLI－100皮升注射泵

在數(shù)字設(shè)定的時(shí)間間隔內(nèi)，通過對其施加一定大小的壓力，PLI－100皮升注射器可以可靠地將一很大容積范圍內(nèi)的物質(zhì)通過微量移液管進(jìn)行輸送。在固定細(xì)胞的同時(shí)，壓縮空氣使儀器的操作者能夠同時(shí)將毫微微升至毫升的所需容積的物質(zhì)準(zhǔn)確地輸送至所需部位。不管您是需要將較大量的物質(zhì)注射進(jìn)移液管中，還是要將極少量的物質(zhì)注射進(jìn)哺乳動物的細(xì)胞核中，PLI－100皮升注射泵都是您實(shí)驗(yàn)的非常合適的選擇。

在一些很有聲望的***微注射實(shí)驗(yàn)室，比如Cold SpringHarbor實(shí)驗(yàn)室中，以及在世界范圍內(nèi)的其他科研人員中，PLI－100皮升注射泵已經(jīng)成為大家所喜愛的產(chǎn)品。盡管其他公司也在試著設(shè)計(jì)相似的微注射系統(tǒng)，但是就使用的簡便性、**性以及成本的低廉性而言，PLI－100皮升注射泵仍然是無人可比的。  

適合用途：

――鼠類、蛙類、斑紋螺以及其他的卵母細(xì)胞的注射。

――腦細(xì)胞外注射。

――DNA、mRNA、微珠、神經(jīng)遞質(zhì)、各種激酶以及其他的蛋白質(zhì)的注射。